赖氨酸生产菌的选育与赖氨酸发酵用消泡剂

发布时间:2012-9-11 11:33
赖氨酸生产菌的选育,可以通过多种途径,多数是通过几个途径的配合进行选育,主要的有以下几个方面: 切断或减弱支路代谢 切断支路代谢:以谷氨酸棒杆菌为出发菌株,选育和应用营养缺陷型突变株,切断苏氨酸和蛋氨酸与赖氨酸发酵用消泡剂的分支途径,是积累赖氨酸的有效措施。赖氨酸生产菌以丧失HD的高丝氨酸缺陷型为主。根据变构酶的S形动力学性质,变构抑制剂苏氨酸的浓度必须在叠值以上才能与赖氨酸一起显示对关键酶AK的协同反馈抑制作用。为此,只要限量苏氨酸,将苏氨酸的胞内浓度控制在阈值以下,便可避开对AK的反馈抑制,积累赖氨酸。 佐野等育得的黄色短杆菌H-1 013 赖氨酸的生成量为42.6 g/L 。高丝氨酸的添加量以供菌体生长的亚适量为宜,并供给充足的发酵用消泡剂赖氨酸与生物素(30μg/L以上)。因为生物素贫乏,使ɑ-酮戊二酸转为谷氨酸,而生物素丰富时,可以转为形成天门冬氨酸,既可以通过草酰乙酸的转氨作用也可以通过延胡索酸的转化作用,天门冬氨酸进一步转化为赖氨酸。 大肠杆菌的反馈抑制和谷氨酸棒杆菌不同,尽管同样选育出高丝氨酸缺陷型,由于天门冬氨酸激酶中的三个同功酶有一个是受赖氨酸抑制和阻遏,当赖氨酸积累时,这一同功酶不能起作用,于是削弱产量。更为重要的是,天门冬氨酸半醛脱氢酶受赖氨酸阻遏,要使赖氨酸过量积累,已属不可能。 高丝氨酸缺陷型变异株对积累赖氨酸最有利,其次是苏氨酸+蛋氨酸缺陷型与发酵用消泡剂赖氨酸,其它营养缺陷型例如苏氨酸缺陷型、蛋氨酸缺陷型均不如高丝氨酸缺陷型。 变换优先合成:优先合成的变换会引起一种终产物的积累。选育高丝氨酸渗漏缺陷型和苏氨酸敏感性突变株可以改变优先合成,积累赖氨酸。例如,通过突变将HD的比活性降低到原来活性的1/30,可以积累20 g/L赖氨酸。选育原养型回复突变株与赖氨酸发酵用消泡剂的方法也能改变HD的活力,变换优先合成。据报道,由黄色短杆菌的高丝氨酸缺陷型,经两次突变育得的原养型回复突变株S-20可产生23 g/L赖氨酸。经研究确认,S-20菌株的HD活力比变株低得多,这是高产的主要原因。 解除反馈调节 选育抗类似物突变株可以得到AK对反馈抑制脱敏的菌株,代谢调节被遗传性地解除,不受培养基成分的影响,生产稳定。这是赖氨酸发酵的重要育种手段,特别是利用赖氨酸发酵用消泡剂和营养缺陷型具有类似物抗性的突变株。 赖氨酸类似物的作用机制,主要是起假反馈抑制剂的作用。因为赖氨酸类似物的结构与赖氨酸相似,易被AK所误认,能像赖氨酸一样,协同苏氨酸一起在AK的变构部位上结合,抑制AK的活性,但这种抑制是不可逆的。倘若为AK编码的结构基因发生突变,使AK脱敏,不再能与类似物相结合而活性中心却不变,就是一个抗反馈抑制的突变株。 抗类似物突变株的筛选方法:为了增强细菌对类似物的敏感性,可采用赖氨酸类似物十苏氨酸或苏氨酸类似物十赖氨酸来筛选AK脱敏的突变株。如将亲株诱变处理后,在含有AEC+苏氨酸或AHV+赖氨酸的培养基上进行平板培养。由于诱变株的生长会把赖氨酸分泌在培养基中,故形成敏感株的增殖圈,选取有明显增殖圈和赖氨酸发酵用消泡剂的抗AEC或抗AHV的突变株,作为赖氨酸发酵的试验株。实践证明,利用营养缺陷型兼抗性或兼具有多重抗性或多缺十多抗性的突变株比单缺或单抗性菌株产酸率高。 本文参考《发酵微生物学》一书。
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