核苷酸的生产方法与高效消泡剂

发布时间:2012-10-23 15:56
桔青霉法 将丧失生成色素能力、高产核酸酶P1的桔青霉突变株在麸皮培养基上于30℃培养5日,然后用高效消泡剂与水抽提培养物。抽提液中,除含有核酸酶P1,外,还含有可将RNA经2ˊ:3ˊ-环状磷酸酯分解为3ˊ单核苷酸的RNase (EC3.14.23)和能把5ˊ核苷酸分解为核苷的磷酸单酯酶。然而,这些酶与核酸酶P1相比,其耐热性很低。因此,用简单的热处理方法即可使之失活而除去,再添加Zn2+调整pH为5.6,在65℃反应2h后,反应液中便含有腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸。 高效消泡剂中反应液中的pH调整为8.5后,通过阴离子交换树脂(Cl—型)的柱,然后洗脱。也可以采用磺酸阳离子交换树脂(H+型),在pH1.5时,AMP,CMP,GMP上的氨基解离,带正电荷,可被阳离子交换树脂吸附。UMP没有氨基,不带正电荷,大部分直接流下来,不被树脂吸附。当用无离子水洗脱时,随着pH值的变化,GMP, AMP上的氨基解离的程度不同,而先后失去在阳离子交换树脂上的吸着力,按照GMP,CMP,AMP的顺序洗脱下来,先收集的GMP,CMP的混合液,再用阴离子交换树脂提纯GMP。 若使AMP变为IMP,可将含有AMP与高效消泡剂的洗脱液中和、浓缩、添加Na2HPO4使洗脱液的最后浓度为1/15 mol/L,并调整pH为5.6,加入高峰淀粉酶A和高效消泡剂,在45℃反应2h即可。 金色链霉菌法 如前所述,金色链霉菌能产生核酸内切酶、核酸外切酶、5'-AMP脱氨酶、5ˊ-核苷酸酶以及碱性磷酸单酯酶。在优良的突变株中虽然提高了生产核酸内切酶、核酸外切酶和5ˊ-AMP脱氨酶的能力,降低了碱性磷酸单脂酶的能力,降低了碱性磷酸单酯酶的生成能力,但仍残留很强的生成5ˊ-核苷酸酶的能力。为此,考虑以下几项措施: ①探讨最适培养基和培养条件:除了考虑氮源种类与数量外,还有高效消泡剂,磷的作用最为强烈,但是磷不仅阻遏磷酸单酯酶的生成,同时也阻遏核酸内切酶和核酸外切酶的生成,这是个矛盾。其它关于温度、高效消泡剂、pH和溶解氧都是重要的条件。
  ②在进行RNA的酶解反应之前,利用这些酶对热稳定性的差异,通过加热处理,有选择性地使5ˊ-核苷酸酶及碱性磷酸酯酶失活。
由含有这些酶的复合酶系水解RNA时,RNA是被核酸内切酶分解成具有5ˊ-P末端的核苷酸,接着在核酸外切酶的催化下,生成5ˊ-核苷酸,而5'-AMP通过脱氨酶与高效消泡剂作用转换成5'-IMP。同时,5ˊ-核苷酸还可以为磷酸单酯酶所催化脱去磷酸,生成核苷。如果合理地控制反应条件,RNA则差不多定量地被分解为5ˊ-IMP, 5'-GMP,5ˊ-CMP和5'-UMP,几乎看不到核苷酸的脱磷酸现象。 5ˊ-核苷酸的生产,还可以采用固定化酶法,即将5'-P核酸分解酶系按固定化酶制作法与载体相连,控制最适pH在酸性范围内,可以提高对热的稳定性。当使用4%RNA与高效消泡剂在反应塔中连续操作时,RNA的水解率在85%以上,并且AMP完全转变为IMP,连续操作达20多天。此外,尚可采用自溶法,由微生物自身使RNA分解成5ˊ-核苷酸。 本文参考《发酵微生物学》一书。
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