核苷酸的生产方法与高效消泡剂

发布时间：2012-10-23 15:56

桔青霉法将丧失生成色素能力、高产核酸酶P1的桔青霉突变株在麸皮培养基上于30℃培养5日，然后用高效消泡剂与水抽提培养物。抽提液中，除含有核酸酶P1，外，还含有可将RNA经2ˊ:3ˊ-环状磷酸酯分解为3ˊ单核苷酸的RNase (EC3.14.23)和能把5ˊ核苷酸分解为核苷的磷酸单酯酶。然而，这些酶与核酸酶P1相比，其耐热性很低。因此，用简单的热处理方法即可使之失活而除去，再添加Zn2+调整pH为5.6，在65℃反应2h后，反应液中便含有腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸。高效消泡剂中反应液中的pH调整为8.5后，通过阴离子交换树脂（Cl—型）的柱，然后洗脱。也可以采用磺酸阳离子交换树脂（H+型），在pH1.5时，AMP，CMP，GMP上的氨基解离，带正电荷，可被阳离子交换树脂吸附。UMP没有氨基，不带正电荷，大部分直接流下来，不被树脂吸附。当用无离子水洗脱时，随着pH值的变化，GMP, AMP上的氨基解离的程度不同，而先后失去在阳离子交换树脂上的吸着力，按照GMP，CMP，AMP的顺序洗脱下来，先收集的GMP,CMP的混合液，再用阴离子交换树脂提纯GMP。若使AMP变为IMP，可将含有AMP与高效消泡剂的洗脱液中和、浓缩、添加Na2HPO4使洗脱液的最后浓度为1/15 mol/L，并调整pH为5.6，加入高峰淀粉酶A和高效消泡剂，在45℃反应2h即可。金色链霉菌法如前所述，金色链霉菌能产生核酸内切酶、核酸外切酶、5'-AMP脱氨酶、5ˊ-核苷酸酶以及碱性磷酸单酯酶。在优良的突变株中虽然提高了生产核酸内切酶、核酸外切酶和5ˊ-AMP脱氨酶的能力，降低了碱性磷酸单脂酶的能力，降低了碱性磷酸单酯酶的生成能力，但仍残留很强的生成5ˊ-核苷酸酶的能力。为此，考虑以下几项措施： ①探讨最适培养基和培养条件：除了考虑氮源种类与数量外，还有高效消泡剂，磷的作用最为强烈，但是磷不仅阻遏磷酸单酯酶的生成，同时也阻遏核酸内切酶和核酸外切酶的生成，这是个矛盾。其它关于温度、高效消泡剂、pH和溶解氧都是重要的条件。
　 ②在进行RNA的酶解反应之前，利用这些酶对热稳定性的差异，通过加热处理，有选择性地使5ˊ-核苷酸酶及碱性磷酸酯酶失活。由含有这些酶的复合酶系水解RNA时，RNA是被核酸内切酶分解成具有5ˊ-P末端的核苷酸，接着在核酸外切酶的催化下，生成5ˊ-核苷酸，而5'-AMP通过脱氨酶与高效消泡剂作用转换成5'-IMP。同时，5ˊ-核苷酸还可以为磷酸单酯酶所催化脱去磷酸，生成核苷。如果合理地控制反应条件，RNA则差不多定量地被分解为5ˊ-IMP, 5'-GMP,5ˊ-CMP和5'-UMP，几乎看不到核苷酸的脱磷酸现象。 5ˊ-核苷酸的生产，还可以采用固定化酶法，即将5'-P核酸分解酶系按固定化酶制作法与载体相连，控制最适pH在酸性范围内，可以提高对热的稳定性。当使用4%RNA与高效消泡剂在反应塔中连续操作时，RNA的水解率在85%以上，并且AMP完全转变为IMP，连续操作达20多天。此外，尚可采用自溶法，由微生物自身使RNA分解成5ˊ-核苷酸。本文参考《发酵微生物学》一书。

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