生产菌株的选育与生物发酵消泡剂

发布时间：2012-11-6 10:44

肌苷的生产菌株多为枯草杆菌腺嘌呤缺陷型由于普遍存在着使IMP脱磷酸化的酶类，所以，比较容易得到积累肌苷和次黄嘌呤的突变株。又由于IMP对细胞膜渗透性很差，因此，肌苷生物发酵消泡剂的发酵比肌苷酸的生物发酵消泡剂发酵来得容易。有人曾研究枯草杆菌嘌呤核苷酸合成中，各种终产物对关键酶的反馈抑制效果，发现PRPP转酰胺酶专一性地受AMP, ADP的完全抑制，但受IMP,GMP, XMP和ATP的抑制却很弱，这是与产气气杆菌等的不同点。在GMP的生物合成中，IMP脱氢酶受GMP抑制最强；其次是ATP, XMP, GTP。IMP生物合成酶系和AMP生物合成酶系为腺嘌呤化合物所阻遏。由IMP合成AMP, GMP两种核苷酸，倾向于优先合成GMP。根据这样的代谢调节机制，使用芽孢杆菌属的腺嘌呤缺陷型突变株进行肌苷生物发酵消泡剂的发酵时，必须在不明显抑制菌体生长的范围内，尽量降低培养基中腺嘌呤浓度（保持在不能引起反馈调节的浓度），从而有利于肌苷的积累。一步选育不受腺嘌呤系核苷酸代谢控制的突变株，也是增加肌苷积累的重要手段。这些突变株的获得包括抗代谢类似物，如抗8-AG（8-氮鸟嘌呤），抗8-AX（8-氮杂黄嘌呤）等。值得注意的是：在诱导8-AGr或8-AXr突变株，选育肌苷高产菌株时，使用的出发菌株应该是丧失腺嘌呤脱氨酶的突变株。这是因为丧失dea，能提高出发菌株对8-AG或8-AX等类似物的敏感性，易于分离到有效的抗性突变株。假如有dea存在，腺嘌呤就会被脱氨化而转变为次黄嘌呤，生成的次黄嘌呤能解除8-AX对菌体生长的抑制作用。另外肌苷分解活性低的菌株对积累肌苷有利。 5-IMP的生产菌株的研究主要分为两种类型由以芽孢杆菌属细菌诱变的肌苷生产菌为出发菌株，进一步诱变，选育遗传性地丧失了生物发酵消泡剂及降解核苷酸酶活性的突变株，育成IMP生产菌；将产量较低的IMP生产菌用遗传的方法或通过对其培养条件的研究，加以改良，提高IMP的积累。选育第一类的生产菌时，必须先了解分解IMP成肌苷的酶，这些酶有5'-核苷酸酶、酸性磷酸酯酶及碱性磷酸酯酶等。使用的菌株究竟是含有哪种酶？此酶分布在细胞内的位置，然后诱变得到降低酶活的突变株。属于第二类的微生物有短杆菌属、棒杆菌属及链霉菌属等，它们与芽孢杆菌不同，其生物发酵消泡剂与降解核苷酸的酶活性本来很弱，这些菌株的腺嘌呤缺陷型能积累肌苷酸、次黄嘌呤，而不积累肌苷。以产氨短杆菌为例，对5ˊ-IMP的生物合成来说，关键酶PRPP转酰胺酶受ATP,ADP,AMP及GMP的反馈抑制（抑制度为70%-100%）。被腺嘌呤阻遏，GMP和AMP是一种协同反馈抑制，当出现腺嘌呤或AMP缺陷型突变株时（丧失SAMP合成酶），在腺嘌呤亚适量下，该酶抑制即被解除。而IMP-XMP的IMP脱氢酶受鸟嘌呤的阻遏和GMP的抑制，因而积累IMP。同理，当出现鸟嘌呤或GMP缺陷突变株时亦能积累IMP。如在具有丧失SAMP合成酶遗传标记的基础上，能再设法增加丧失IMP脱氢酶的标记，即成为腺嘌呤和黄嘌呤缺陷型，IMP产量显著提高。腺苷和5ˊ-腺苷酸的生产菌株选育曾报道有这样两种异亮氨酸缺陷型菌株，培养基中异亮氨酸添加浓度控制在0.2-0.3mg／ml为宜，关于异亮氨酸缺陷与腺苷积累的关系，目前尚未搞清；②黄嘌呤和鸟嘌呤双重缺陷型菌株。 5ˊ鸟嘌呤的制造方法 ①利用微生物友酵法生产5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸，然后化学法制成GMP；②生物发酵消泡剂的发酵生产鸟苷，然后以酶法或化学法进行磷酸化得到GMP；③利用XMP或黄苷生产菌与能将XMP或黄苷转化为GMP的菌株混合培养生产GMP；④直接生物发酵消泡剂的发酵法生产GMP。目前①和②用于工业生产。直接生物发酵消泡剂的发酵生产GMP，必须具备如下条件：①应当解除GMP生物合成的调节机制，首先要设法解除GMP对IMP脱氢酶的终产物抑制作用；②由于GMP与IMP一样难于透过细胞膜，所以在解除反馈抑制前提下，还应设法改善细胞膜渗透性；③不分解生成的GMP。本文参考《发酵微生物学》一书。

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